(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210914720.3 (22)申请日 2022.08.01 (71)申请人 沈阳药科大学 地址 117004 辽宁省本溪市高新 技术产业 开发区华佗大街26号 (72)发明人 孙孟驰　孙进　刘福囝　班玮越　 (74)专利代理 机构 沈阳东大知识产权代理有限 公司 21109 专利代理师 李珉 (51)Int.Cl. A61K 9/50(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 35/761(2015.01) A61P 35/00(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 15/53(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称 基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉 递送系统及其构建方法和应用 (57)摘要 基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉 递送系统及其构建方法和应用， 属于药物制剂新 辅料和新剂型领域， 通过基因工程手段获取含 氧 化酶的OMVs， 以该囊泡为载体， 利用仿生矿化技 术在其表 面修饰纳米级无定形外壳， 通过挤压 法 在其内部荷载Ads。 该系统屏蔽了表位抗原， 能够 延长在体循环时间， 通过EPR 效应促进Ads在肿瘤 处的富集。 利用氧化酶的催化作用有效提升肿瘤 内氧化应激水平， 促进癌细胞过度自噬， 并以自 噬体为复制位点， 增加Ads复制效率。 OMVs作为免 疫激活剂， 重塑肿瘤免疫抑制微环境， 进而增强 Ads介导的抗肿瘤免疫响应。 本发明为溶瘤病毒 介导的抗肿瘤免疫增效提供重要的理论基础和 可行的解决策略。 权利要求书2页 说明书6页 附图9页 CN 115252576 A 2022.11.01 CN 115252576 A 1.一种基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统， 其特征在于， 该系统是以 工程化细菌外膜囊泡为载体， 内部荷载溶瘤病毒， 外部进行仿生矿化形成纳米级无定形外 壳而制成的仿生矿化复合微生物体； 溶瘤病毒与细菌外膜囊泡总蛋白含量比例为1:2～1: 20； 仿生矿化过程所 添加金属阳离 子与复合 微生物体总蛋白质量比为1:10～10:1。 2.根据权利要求1所述的基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统， 其特征 在于， 其中， 所述的溶瘤病毒为溶瘤腺病毒； 所述的工程化细菌外膜囊泡为高表达氧化 酶的 细菌所分泌的细菌外膜囊泡； 所述的仿生矿化形成的纳米级无定形外壳选 自磷酸钙、 碳酸 钙、 草酸钙、 硫酸钙、 碳 酸锰。 3.根据权利要求1所述的基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统， 其特征 在于， 所述的高表达氧化酶选自吡喃糖氧化酶、 葡萄糖氧化酶； 所述的细菌选自E.coli ‑ BL21、 E.coli ‑1917、 E.coli ‑K12、 E.coli ‑MG1655、 E.coli ‑TOP10、 奥奈达希瓦氏菌MR ‑1、 减 毒沙门氏菌VNP20 009、 蛭弧菌 。 4.一种权利要求1 ‑3任一项所述基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病 毒静脉递送系统的 构建方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)工程化OMVs的构建与确证 ①将氧化酶的质粒导入到细菌中进行表达； ②将完成表达的细菌在传统Luria ‑Bertani培养基中培养， 而后加入0.5mM异丙基 ‑β‑ D‑硫代半乳糖苷， 震荡； ③4℃低温离心收集细菌， 弃上清液后加入PBS重悬， 稀释后加入葡萄糖溶液， 37℃孵 育； ④加入ABTS和辣 根过氧化物氧化酶， 混匀， 静置， 变蓝则证明有氧化酶的存在； ⑤将表达成功的工程菌于4℃静置， 离心， 弃去沉淀， 收集上清液， 过滤后收集滤液， 将 滤液浓缩100倍， 离心， 弃去上清液， 用PBS重悬， 过 滤后置于4℃低温环境中静置保存； ⑥OMVs中氧化酶确证方法同步骤 ④， 采用动态光散射、 透射电镜方法验证OMVs的粒径、 电位和形态； (2)复合微生物体的构建与确证 ①将一定量的Ads按比例分散 于含工程 化OMVs的细胞培 养基中， 混匀； ②利用脂质体挤出器， 将分散液用滤膜过膜挤压， 收集 挤出后的复合 微生物体分散液； ③复合微生物体 中氧化酶确证方法同步骤(1) ④， 并采用动态光散射、 透射电镜方法验 证复合微生物体的粒径、 电位和形态； (3)仿生矿化复合 微生物体的构建与确证 ①将已构建完成的复合微生物体的分散液斡旋分散， 按每1mg蛋白含量加入0.1～ 10mg 的金属阳离 子和阴离 子等比例进行仿生矿化； ②静置， 弃去底部矿化沉淀杂质， 200000 ×g超速离心1～2h收集仿生矿化复合微生物 体； ③采用动态光散射、 透射电镜及mapping半定量能谱分析方法验证仿生矿化复合微生 物体的粒径、 电位和形态。 5.根据权利要求4所述基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统的构建方 法， 其特征在于， 所述步骤(1) ①中， 所述氧化酶选自吡喃糖氧化酶、 葡萄糖氧化酶； 所述细权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115252576 A 2菌选自E.coli ‑BL21、 E.coli ‑1917、 E.coli ‑K12、 E.coli ‑MG1655、 E.coli ‑TOP10、 奥奈达希 瓦氏菌MR‑1、 减毒沙门氏菌VNP20 009、 蛭弧菌 。 6.根据权利要求4所述基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统的构建方 法， 其特征在于， 所述步骤(1) ⑤中， 具体操作如下： 将表达成功的工程菌于4℃静置， 分装于 离心筒中3500rpm/min离心， 弃去沉淀， 收集上清液， 用0.45 μm的无菌滤膜过滤后收集滤液， 将滤液用100kDa的超滤浓缩管浓缩100倍， 于200000 ×g超速离心2h， 弃去上清液， 用PBS重 悬， 过0.45 μm滤膜后置 于4℃低温环境中静置保存， 使用前仍需再 过0.45 μm滤膜。 7.根据权利要求4所述基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统的构建方 法， 其特征在于， 所述步骤(2) ②中， 将分散液用100～1000nm的滤膜过膜挤压5～30次， 收集 挤出后的复合 微生物体分散液。 8.权利要求1 ‑3任一项所述的基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病 毒静脉递送系统在药 物传递系统中应用。 9.权利要求1 ‑3任一项所述的基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病 毒静脉递送系统在制 备抗肿瘤药物中应用。 10.权利要求1 ‑3任一项所述的基于工程化细菌外膜囊泡的溶瘤病毒静脉递送系统在 制备注射给 药、 口服给 药或局部给 药系统中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115252576 A 3