ICS 67.120.20 B 40 团体 标准 T/SHZSAQS 014—2020 肉牛促性腺激素释放激素免疫去势 技术规程 2020- 12 - 26发布 2020 - 12 -31实施 石河子市质量标准化协会 发布 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 014—2020 I 目 次 前言 ................................ ................................ ............... III 1 范围 ................................ ................................ .............. 1 2 术语和定义 ................................ ................................ ........ 1 2.1促性腺激素释放激素（ GnRH） ................................ ........................ 1 2.2 GnRH短肽 ................................ ................................ ........ 1 3 肉牛GnRH疫苗的制备方法 ................................ ........................... 1 3.1 GnRH疫苗的抗原表位 ................................ .............................. 1 3.2 GnRH疫苗抗原与载体蛋白连接 ................................ ...................... 2 3.3 GnRH疫苗抗原乳化 ................................ ................................ 2 4 肉牛GnRH免疫去势程序 ................................ ............................. 2 4.1 免疫月龄 ................................ ................................ ........ 2 4.2免疫注射方法及剂量 ................................ ................................ 2 4.3加强免疫时间及剂量 ................................ ................................ 2 4.4 GnRH免疫效果评定 ................................ ................................ 2 4.4.1临床评价 ................................ ................................ ........ 2 4.4.2病理评价 ................................ ................................ ........ 2 4.4.3疫苗评价 ................................ ................................ ........ 3 附录A（资料性附录） 肉牛睾丸组织切片 ................................ ........ 3 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 014—2020 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 本标准附录 A为资料性附录。 本标准起草单位：新疆农垦科学院畜牧兽医研究所、新疆天山军垦牧业有限责任公司。 本标准主要起草人：徐梦思、甘尚权、陈红莉、孟季蒙、吴妍妍。 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 014—2020 1 肉牛促性腺激素释放激素免疫去势技术规程 1 范围 本规程规定了肉牛促性腺激素释放激素免疫去势的术语和定义、肉牛促性腺激素释放激素疫 苗的制备方法、 肉牛促性腺激素释放激 素免疫去势程序、 促性腺激素释放激素免疫效果评定等技术 内容。 本规程适用于肉牛促性腺激素释放激素免疫去势。 2 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1促性腺激素释放激素（ GnRH） 促性腺激素释放激素是由下丘脑分泌的，能刺激或抑制垂体促性腺激素的神经激素，对动物生 殖起重要调控作用。 2.2 GnRH 短肽 天然的GnRH短肽是由谷氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸及 脯氨酸组成的 10个氨基酸残基短肽。 3 肉牛GnRH疫苗的制备方法 3.1 GnRH疫苗的抗原表位 根据自然界中 GnRH短肽序列，本标准将在基础上将第 6位甘基酸由 D型赖氨酸取代，并通过 改变构象本标准共设计 3种GnRH抗原表位用于肉牛的免疫去势，分别为：二串子双半胱氨酸、二 串子α螺旋、四串子 α螺旋，详细抗原表位序列见表 1。 表1 GnRH抗原表位序列 GnRH抗原名称 氨基酸序列 二串子双半胱氨酸 CQHWSYKLRPGQHWSYKLRPGC -NH 2 二串子α螺旋 pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGC -NH 2 四串子α螺旋 pEHWSYKLRPGMALQHWSYKLRPGALMQHWSY KLRPGLAMQHWSYKLRPGC -NH 2 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 014—2020 2 3.2 GnRH 疫苗抗原与载体蛋白连接 GnRH抗原经高效液相色谱（ HPLC）纯化后，纯度＞ 90%，采用碳二亚胺法将 GnRH抗原与大载体卵 清蛋白（OVA）连接，GnRH抗原与OVA载体蛋白连接后构成 GnRH-OVA复合物，偶联率达 80%。 3.3 GnRH疫苗抗原乳化 将GnRH-OVA复合物溶于 PBS（pH=7.4）中，用 Span白油佐剂充分乳化，将制备好的乳化液密封后 放置于4 ℃恒温环境中，观察乳液性状，无分层情况，性状保持良好；并将乳化液滴与纯净水上静置， 无散开、破乳现象，说明该 GnRH疫苗稳定性较好，可用于后期免疫去势。 4 肉牛GnRH免疫去势程序 4.1 免疫月龄 随机选取13月龄的需进行免疫去势的肉牛。 4.2免疫注射方法及剂量 选择一次性注射器及针头， 采取颈部皮下注射的方法免疫 1 mL GnRH去势疫苗 （含 GnRH约500 µg）。 在疫苗注射过程中要确保操作规范，避免注射到脂肪层造成疫苗的浪费， 注射后要注意观察注射部位是 否有起包等不良反应。在注射时要确保每头牛一个针头，避免交叉感染。 4.3加强免疫时间及剂量 为了保证 GnRH疫苗的免疫效果，初免后，间 隔1个月以相同剂量与注射方法对肉牛进行一次强化 免疫。免疫时要做好记录工作，包括牛的编号、免疫时间、免疫剂量、操作人员等。 4.4 GnRH 免疫效果评定 4.4.1临床评价 免疫去势后观察公犊牛的日常行为，发现未进行免疫的公犊牛会频繁出现爬跨现象，并且群体间有 打斗攻击行为，而经 GnRH主动免疫后的公犊牛无爬跨现象及攻击行为，但会出现被爬跨现象，出现以 上行为说明 GnRH疫苗主动免疫效果良好，能够有效的降低动物的攻击行为和性行为。 4.4.2病理评价 取免疫与未免疫公牛单侧睾丸组织置于 4 %中心甲醛中固定，将睾丸 组织进行组织石蜡切片连续切 10张6μm厚度切片，经苏木素 -伊红染色后，光学显微镜下观察。未免疫公牛睾丸组织中，曲精细管排 列整齐，管腔内各级生精细胞层次清晰，层数正常，精原细胞向管腔内发育，分化为初级精母细胞、精 子细胞和精子，精子数量较多，上皮组织完整，支持细胞和间质细胞分布均匀；而 GnRH疫苗免疫后的 公牛睾丸组织发生明显空泡变性，曲细精管生殖上皮明显萎缩，管腔内精原细胞、精母细胞及精子细胞 全国团体标准信息平台 T/SHZSAQS 014—2020 3 层次减少且不分明，在曲精小管内仅见一两层退化的精原细胞，腔内无精子或极少精子，管腔空荡间质 组织疏松，细胞数量明显减少。 4.4.3疫苗评价 初次免疫当天记为 0 周，初免当天起每 隔2周采集免疫公牛尾静脉血样 1.5 mL，直至屠宰，采集 的血样3000 rpm 离心15min，分离血清，采用 酶联免疫吸附剂测定（ ELISA）法检测血清中 GnRH抗体 水平。 附 录 A （资料性附录） 肉牛睾丸组织切片