ICS 65.020.30 B 43 备案号：60857-2018 青 海 DB 63 省 地 方 标 准 DB 63/T 1693—2018 青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程 2018 - 09 - 25 发布 青海省质量技术监督局 2018 - 12 - 01 实施 发 布 DB 63/T 1693—2018 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由青海省农牧厅提出并归口。 本标准起草单位：青海省家畜改良中心。 本标准起草人：莫延新、谢秀梅、冯宇诚、张晋青、补海平、袁海洲、王廷艳、杨玉芹、李梦怡、 谭建宁、扈添琴、潘顺利、马元梅、胡宁玺、白坤云。 I DB 63/T 1693—2018 青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程 1 范围 本标准规定了青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作过程中供体羊的选择和饲养管理、超数排卵、准备工作、 手术冲胚、胚胎质量鉴定、胚胎玻璃化冷冻、标记和贮存。 本规程适用于青海省高原型、山谷型、欧拉型藏羊冷冻胚胎制作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 1674 胚胎质量检测技术规程 DB63/T 039 青海藏羊 DB63/T 547.1 青海藏羊饲养管理技术规范 3 术语及定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 供体羊 提供胚胎的羊个体。 3.2 超数排卵 利用生殖激素提高供体羊同期卵泡发育数量和卵子数量的技术。 3.3 冲胚 配种后第7 d ，用冲卵管等装置，把供体母羊子宫内的胚胎冲洗出来的过程。 3.4 检胚 对胚胎进行清洗、质量鉴定和分级的过程。 3.5 1 DB 63/T 1693—2018 超低温保存 胚胎放置在液氮中长期保存。 3.6 胚胎玻璃化冷冻 应用高浓度防冻剂，使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近，控制防冻剂与 胚胎的平衡时间和温度，使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体，直 接投入液氮中保存。 4 种公羊的选择和饲养管理 4.1 种公羊的选择 体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T 039要求，具有种用价值，体质健康无疫病。 4.2 种公羊的饲养管理 种公羊按照DB63/T 547.1规定，补充优质蛋白质、维生素A、维生素E及无机盐等矿物质，做到科学 饲喂，适当运动,保证中等膘情，在本交前不宜吃的过饱。 5 供体羊的选择和饲养管理 5.1 供体羊的选择 体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T 039要求，生殖机能正常，体质健康无疫病。 5.2 供体羊的饲养管理 供体羊在采胚前后按照DB63/T 547.1规定，对供体羊补充能量、蛋白质、维生素和矿物质，并供给 充足清洁饮水，做到科学饲喂，保证中等膘情。 6 超数排卵 6.1 超数排卵时间 供体羊超数排卵开始处理时间，应在诱导发情的第9 d进行。 6.2 超数排卵性腺激素选择 促卵泡素（FSH）、促黄体素释放激素A3（促排3号）、氯前列烯醇（PG）、孕激素阴道栓塞（CIDR）。 6.3 超数排卵处理方法 超数排卵方法：促卵泡素多次注射法（FSH多次注射法）。首先放置阴道栓塞，以放置阴道栓栓塞 为发情周期第0 d，从第9 d开始，每天上、下午间隔12 h采用逐渐减量的方法肌注促卵泡素（FSH）， 连续注射4 d，注射第6针促卵泡素（FSH）时同时注射氯前列稀醇（PG）0.2 mg，在注射第7针促卵泡素 （FSH）时取出阴道栓。 2 DB 63/T 1693—2018 剂量:根据促卵泡素（FSH）药用剂量，依据供体母羊体重增减。 6.4 发情鉴定及配种 在第12 d下午注射最后一针促卵泡素（FSH）时，即对供体羊进行发情鉴定，用试情公羊进行试情， 每20只供体母羊放1只试情公羊，以供体羊站立接受爬跨并完成本交过程为止，间隔8 h ~12 h再配1次， 连续配种2次~3次，同时，对供体羊每次配种结束后注射促黄体素释放激素A3（促排3号）20 μg 和维 生素ADE 3 ml，做好标记与记录。 7 确定冲胚时间 配种后的第7 d从子宫回收胚胎。 8 准备工作 8.1 手术室要求 2 胚胎采集要在专门的手术室内进行，手术室要求洁净明亮，光线充足，面积宜大于15 m 以便于操 作。配备照明用电,室内温度保持在20 ℃ ~ 25 ℃，手术前用紫外灯照射1 h ~ 2 h。 8.2 供体羊准备 供体羊手术前停食12 h，供给适量饮水。 8.3 术者准备 术者剪短指甲，用指刷、肥皂水清洁，并进行消毒，术者需穿清洁手术服，戴工作帽和口罩。 8.4 冲胚主要器械药品 8.4.1 器械设备 液氮罐、手术保定架、恒温水浴锅、高压消毒锅、超声波洗涤仪、1000 ml容量瓶、超纯水器、电 热鼓风干燥箱、体视镜、羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、手术器械、创伤巾。 8.4.2 药品 酒精、碘酊、新洁尔灭、0.9 %生理盐水、盐酸普鲁卡因青霉素、麻醉剂、清醒剂、氯前列烯醇（PG）。 8.5 冲胚保存液的配制 含犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液。杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配制方法见附录A。 9 手术冲胚 9.1 供体羊的保定和麻醉 供体羊仰放在手术保定架上，四肢固定，通过肌肉注射药物进行全身麻醉处理。 9.2 手术部位及其消毒 3 DB 63/T 1693—2018 手术部位在乳房前腹中线与后肢股内侧的交汇处。经剃毛和清水清洗手术部位后，涂以2%的碘酒做 消毒处理，待干后再用75 %的酒精棉脱碘，盖上创伤巾。 9.3 手术操作 9.3.1 组织分离 避开血管，在手术部位纵向切开5 cm ~ 8 cm长的切口，切口方向与组织走向尽量一致，肌肉切开 采用钝性分离。 9.3.2 引出子宫角和输卵管 切开后，在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫角，摸到后用二指夹持，引出子宫角、输卵管、卵巢。 记录左右卵巢表面的卵泡数和黄体数。 9.3.3 冲胚 子宫角冲胚法：用尖嘴镊子在子宫体扎孔，将冲卵管插入，使气球在子宫角分叉处，并注入空气， 使气球膨胀，冲卵管外接集卵杯。滞留针从子宫角尖端插入，当确认针头在管腔时，进退畅通，用注射 器吸入含有空气的冲胚液30 ml，推入子宫，冲胚液从子宫体冲胚管流出，流入集卵杯。另一侧子宫角 用同样的方法冲胚。 9.3.4 术后处理 采胚完毕后，在子宫手术部位涂适量盐酸普鲁卡因青霉素，复位器官，用37 ℃灭菌生理盐水冲去 血凝块，湿润母羊子宫。手术中出血应及时止血，对常见的毛细管出血或渗血，用纱布敷料轻压出血处 即可。小血管出血可用止血钳止血，较大血管出血除用止血钳夹住暂时止血外，必要时做缝合处理。 9.3.5 伤口缝合 供体母羊创口采用两层缝合法，即腹膜与肌肉单纯连续缝合，外皮单纯间断缝合。缝合后，在伤口 周围涂抹碘酊，肌注清醒剂和氯前列烯醇。 10 胚胎质量鉴定 10.1 镜检 过滤杯法：检胚时先用冲卵液冲洗集卵杯过滤网，并滤去集卵杯中多余的回收液，使液面低于过滤 网，在体视镜下根据集卵杯底网格顺序捡取胚胎。 10.2 胚胎的鉴定和分级 胚胎的鉴定和分级按照NY/T 1674进行。 A、B级胚胎可用于进行冷冻。胚胎冷冻前，要在杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）中冲洗10次。 11 胚胎玻璃化冷冻 11.1 冷冻溶液配制 冷冻溶液具体配制方法见附录B。 4 DB 63/T 1693—2018 11.2 玻璃化胚胎制作及冷冻 11.2.1 细管二步法 首先在10 % EG预处理液中平衡5 min，然后将胚胎移入事先装好玻璃化溶液的0.25 ml塑料细管内， 快速完成装管和封口，在25 s内投入液氮中冷冻保存。玻璃化冷冻保存胚胎细管（0.25 ml）溶液配置 顺序见图1。 11.2.2 开放式拉长细管(open pulled 65straw，OPS)法 用酒精灯明火将0.25 ml细管中部加热拉细，并拉长至22 cm，用刀片切除细管棉塞段，然后在9.5 cm 处的细管中间切断，即制成OPS管，其管壁内径约为0.8 mm ~ 1 mm，管壁厚0.08 mm。 室温为25 ℃，胚胎操作于37 ℃恒温台上进行。首先用与口吸管相连的OPS将胚胎移入10 % EG中平 衡30 s，然后移入玻璃化溶液中平衡25 s后投入液氮中保存。玻璃化冷冻保存胚胎细管（0.25 ml）溶 液配置顺序见图1。 4 1 2 3 2 1 说明： 1 — 栓； 2 — 0.5mol/l蔗糖液； 3 — 空气； 4 — 玻璃化溶液。 图1 玻璃化冷冻保存胚胎细管（0.25 ml）溶液配置顺序 11.3 标记和贮存 11.3.1 标记 OPS管装入离心管进行标记，细管在细管塞上进行标记，标记信息为：第1行注明品种、供体羊号， 第2行注明胚胎阶段、级别、数量、冷冻方法，第3行注明制作日期；同时记录《青海藏羊胚胎冷冻记录 表》 （见附录C） 。 11.3.2 贮存 将标记后的胚胎细管存放在液氮生物容器中。液氮生物容器符合GB/T 5458 。 12 解冻 12.1 细管二步法解冻 5 DB 63/T 1693—2018 解冻在25 ℃室温下，将细管从液氮中取出，空气中10 s，迅速移入25 ℃水浴中平行晃动10 s，待 细管内蔗糖部分由乳白变为透明时，取出细管，拭去细管表面水分，剪掉封口端，用直径小于细管内径 的金属杆推动棉栓，将细管内容物推入含有0.5 mol/l蔗糖液的表面皿中，在实体显微镜下回收胚胎， 然后将胚胎移入新鲜的0.5 mol/l蔗糖液滴中平衡5 min，以脱出细胞内部抗冻保护剂，最后用PBS液洗 净胚胎。 12.2 开放式拉长细管(open pulled 65straw，OPS)法解冻 解冻在25 ℃室温下，将冷冻的OPS管由液氮中取出后直接浸入含有0.5 mol/l蔗糖液的表面皿中解 冻，然后将回收的胚胎移入新鲜的0.5 mol/l蔗糖液中平衡5 min，以脱出抗冻保护剂，最后用PBS洗净 胚胎。 6 DB 63/T 1693—2018 AA 附 录 A （资料性附录） 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方 表A.1给出了杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方。A、B原粉配方见表A.1，将A、B原粉分别用灭菌双蒸 水冲洗入容量瓶定容至1000 ml，并加入犊牛灭活血清10 ml，充分混匀待用。 表A.1 杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方 试剂名称 A 原粉 B 原粉 浓 度 NaCl 8.0 g/l KCl 0.20 g/l CaCl2 0.10 g/l MgCl2 6H2O 0.20 g/l Na2HPO4 7H2O 2